西北农林科技大学园艺学院
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果树逆境生物学团队揭示转座子MITE-MdRF1通过影响MdRFNR1-1表达进而调控苹果抗旱的分子机制

来源:   作者:张琼琼 牛春东   发布日期:2022-08-02     浏览次数:

     

近日,园艺学院果树逆境生物学团队管清美课题组在植物学顶级期刊《Plant Cell》在线发表了题为“Methylation of a MITE insertion in the MdRFNR1-1 promoter is positively associated with its allelic expression in apple in response to drought stress”的研究论文。该研究揭示了转座子MITE-MdRF1通过影响MdRFNR1-1表达进而调控苹果抗旱的分子机制。

转座子(Transposable element, TE)广泛分布于真核生物基因组中,是一种可移动的DNA单元,通常情况处于沉默状态以维持基因组的稳定性。为了抑制其转座活性,宿主基因组通过RdDM(RNA-directed DNA methylation)途径使其DNA发生甲基化,进而维持转座子的表观沉默。植物基因组中转座子的插入对于植物来说并非都有害处,转座子会引入新的 cis -element或者通过DNA的甲基化,从而产生遗传和表观遗传的变异而产生新的基因表达模式,进而影响植物的生长发育和抗逆性状,例如血橙的红色和玉米的抗旱。因此,转座子并非是junk DNA片段,其对于推动植物的进化起到重要作用。然而,转座子在植物逆境响应中的作用仍知之甚少。 干旱胁迫对于果树的生长发育及果园的生态完整性影响重大,植物通过多种机制应对干旱胁迫,氧化还原途径是植物耐旱机制的重要组成部分。RFNR(Root-type ferredoxin-NADP+ oxidoreductase,根型铁氧还蛋白-NADP+氧化还原酶)被报道参与植物体内的氧化还原平衡,然而其是否参与抗旱还未曾报道,植物 RFNR 是否存在自然变异而影响抗旱并不清楚。

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该课题组从PEG模拟干旱处理的RNA-seq数据中发掘到 RFNR1 基因,其表达受PEG诱导表达。鉴于苹果的杂合性,研究人员以GL-3(皇家嘎啦的实生后代,用于苹果转基因的背景材料,二倍体)为研究对象,从中克隆得到苹果 RFNR1 的等位基因 MdRFNR1-1 和 MdRFNR1-2 ,这两个等位基因编码的蛋白具有三个氨基酸的差异,但体外酶活实验和转基因愈伤的PEG处理实验表明其功能并无差异(图1),均能对NADPH起到催化作用及对干旱胁迫起正调控功能。随后,RFNR1的功能在转基因植物中得到验证。

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图1. NADPH依赖的MdRFNR1等位基因编码蛋白的酶活性

该研究发现, MdRFNR1 的两个等位基因表达水平存在差异, MdRFNR1-1 的表达水平显著高于 MdRFNR1-2 ,PEG诱导 MdRFNR1-1 表达而非 MdRFNR1-2 。进一步研究发现 MdRFNR1-1 的启动子区域存在MITE的插入,并命名为MITE-MdRF1。GUS实验表明MITE-MdRF1在促进基因表达及干旱胁迫的诱导中起到重要作用(图2)。进一步的实验表明,MITE-MdRF1对于 MdRFNR1-1 的调控在苹果抗旱中起正调控功能。

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图2. MITE插入MdRFNR1-1启动子与等位基因的表达和干旱胁迫诱导相关

通过PCR基因分型发现,在检测的371个苹果品种和资源中,有30个苹果种质的 RFNR1 启动子中存在MITE-MdRF1插入。为了进一步确认MITE-MdRF1插入 RFNR1 启动子与苹果自然背景下的耐旱性之间的联系,研究人员挑选了部分种质进行叶片失水处理并测定POD(过氧化物酶)和CAT(过氧化氢酶)活性以及MDA(丙二醛,反应干旱胁迫下细胞完整性)含量。结果表明,在叶片失水处理后, RFNR1 启动子区域含有MITE-MdRF1插入的种质具有更高的POD和CAT活性,以及更低的MDA累积(图3)。

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图3. MITE插入不同种质RFNR1启动子与叶片失水下的MDA含量、POD和CAT活性相关

研究进一步表明MITE-MdRF1处具有24-nt sRNA的积累,可能会通过RdDM途径而引起DNA的甲基化,locus-specific BS-seq、McrBC-qPCR及5-AZA(DNA甲基化抑制剂)处理证明MITE-MdRF1发生甲基化,且甲基化程度受PEG模拟干旱诱导(图4)。

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图4. MITE-MdRF1的DNA甲基化与MdRFNR1-1响应干旱胁迫正相关

甲基化程度升高通常会抑制基因的表达,而本研究表明甲基化程度与基因表达正相关,基于前人的报道,研究人员对其可能的机制进行了深入研究。SUVH1和SUVH3可作为DNA甲基化识别蛋白,通过招募DNAJ1和DNAJ2蛋白形成蛋白复合体,进而促进基因表达。本研究通过DAP-qPCR及双荧光素酶试验证明苹果中MdSUVH1和MdSUVH3可结合于甲基化MITE-MdRF1,并通过与MdDNAJ1、MdDNAJ2和MdDNAJ5形成蛋白复合体进而激活 MdRFNR1-1 基因的表达(图5)。随后通过转基因植物和苹果愈伤组织证明了MdSUVH1和MdDNAJ1在促进苹果抗旱中的功能。

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图5. MdSUVH-MdDNAJ蛋白复合体结合甲基化MITE-MdRF1并激活MdRFNR1-1以响应干旱胁迫

综上所述,该研究揭示了干旱胁迫条件下MITE的插入对 MdRFNR1-1 顺式调节中的作用(图6),并且这项工作提供了一个额外的案例,其中TE插入和DNA甲基化与转录呈正相关。

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图6. 调控模块“MdSUVH–MdDNAJ蛋白复合体—MITE-MdRF1—MdRFNR1-1”影响苹果抗旱性的工作模型

博士研究生牛春东、姜丽娟及曹富国为该论文共同第一作者,管清美教授为该论文通讯作者,马锋旺教授及李超教授在本研究中提供了指导与帮助。本研究得到国家自然科学基金(32172530)、深圳市中央引导地方科技发展专项资金(2021SZVUP117)、陕西省科技重大专项(2020zdzx03-01-02)及博士后科学基金(2021M702692)的资助。

文章链接:https://doi.org/10.1093/plcell/koac220


编辑:张琼琼     终审:徐凌飞