近日， Plant Biotechnology Journal 杂志在线发表了我院王西平教授课题组的研究论文“A module with multiple transcription factors positively regulates powdery mildew resistance in grapevine”。该研究证实，转录因子 VqWRKY46 通过诱导更强的过敏性细胞坏死（HR）、积累更多的过氧化氢（H₂O₂）和胼胝质，并上调多种防御相关基因的表达，显著增强了葡萄对白粉病的抗性。进一步研究表明， VqWRKY46 受到上游转录因子VqLIMYB的正调控，并能与转录因子VqNF-YC9互作，促进后者基因的表达。同时，VqWRKY46还可直接靶向抗性（R）基因 VqDSC1 并激活其转录；尽管VqNF-YC9本身无法结合 VqDSC1 ，但其与VqWRKY46的互作增强了对 VqDSC1 的转录激活作用。该研究揭示了中国野生毛葡萄VqLIMYB-VqWRKY46/VqNF-YC9- VqDSC1 信号模块调控白粉病抗性的分子机制，为葡萄抗病分子育种提供了新的理论基础。
葡萄白粉病（PM）是由葡萄钩丝壳菌（ Erysiphe necator Schw. (syn. Uncinula necator [Schw.] Burr.)）引起的一种真菌性病害(Gadoury et al., 2012)，严重制约着葡萄和葡萄酒产业的发展。研究表明，植物主要通过病原物相关分子模式触发的免疫反应（PTI）和效应因子触发的免疫反应（ETI）抵御病原菌入侵。在ETI过程中，核苷酸结合富亮氨酸重复受体（NLRs，即R基因编码产物）能够识别病原菌分泌的效应蛋白，激活下游信号传导通路，最终引发HR反应（Jones & Dangl, 2006）。前期课题组通过转录组分析并结合异源过表达验证，发现转录因子 VqWRKY46 是葡萄白粉病的正调控因子（Zhao et al., 2018; Jiao et al., 2021）。此外，MYB、NF-YC等转录因子家族亦被证实参与植物病原菌抗性调控（Chezem et al., 2017; Qi et al., 2019）。然而，这些转录因子在葡萄中的具体功能及调控白粉病抗性的分子机制仍不明确。西北农林科技大学园艺学院王西平教授课题组在此基础上，揭示了中国野生毛葡萄‘商-24’中VqLIMYB-VqWRKY46/VqNF-YC9- VqDSC1 信号模块调控葡萄抗白粉病的分子机制，为葡萄抗病遗传育种提供了关键理论依据。全文主要研究结果如下：
1. VqWRKY46 是葡萄白粉病正调控因子
为明晰 VqWRKY46 在葡萄中的抗病功能，该研究借助农杆菌介导的体细胞胚转基因体系（Zhang et al., 2021），成功获得 VqWRKY46 稳定过表达株系（OE#4、OE#33）和干扰株系（RNAi#16、RNAi#32）（图1a）。接种葡萄白粉菌9 d后，与野生型（WT）相比，过表达植株表现出分生孢子数量减少、菌丝长度缩短，同时伴随胼胝质积累增加、过氧化氢（H₂O₂）含量升高及HR反应增强等现象（图1b-f），以及防御相关基因的表达水平显著上调（图1g）；而干扰植株的表型则呈现相反趋势（图1）。上述结果证实， VqWRKY46 正向调控葡萄对白粉菌的抗性。
图1 VqWRKY46 增强转基因葡萄对白粉病抗性
2.VqLIMYB直接结合 VqWRKY46 启动子上Myb motif（CAGTTA）并促进其表达
为探究 VqWRKY46 的上游调控机制，该研究通过酵母单杂交（Y1H）文库筛选，鉴定到转录因子VqLIMYB。生物信息学分析显示， VqWRKY46 启动子区域存在MYB家族转录因子的典型结合基序（Myb motif: CAGTTA）。Y1H试验证实，VqLIMYB可特异性结合该启动子区域（图2a）。进一步的凝胶迁移实验（EMSA）表明，VqLIMYB与Myb motif元件的直接互作具有序列特异性（图2b）。双荧光素酶报告系统（DLR）及GUS活性检测结果显示，VqLIMYB可显著增强 VqWRKY46 启动子的转录活性（图2c-e）。上述结果表明，VqLIMYB通过直接结合 VqWRKY46 启动子上的Myb motif元件，激活其表达。通过瞬时转化技术获得 VqLIMYB 过表达和缺失转基因植株（OE- VqLIMYB 、RNAi- VqLIMYB ），接种白粉菌后的表型分析显示， VqLIMYB 过表达显著增强葡萄对白粉病的抗性（图2f-h）。
图2 VqLIMYB结合 VqWRKY46 启动子上Myb motif并激活其转录
3.VqWRKY46与VqNF-YC9相互作用并促进 VqNF-YC9 的转录
为解析VqWRKY46的互作蛋白网络，该研究利用酵母双杂交（Y2H）文库筛选获得转录因子VqNF-YC9。通过Y2H验证、双分子荧光互补（BiFC）、分裂荧光素酶互补（Split-LUC）、Pull-down及荧光共振能量转移（FRET-AB）等试验，证实VqWRKY46与VqNF-YC9存在直接互作（图3）。此外还发现，VqWRKY46与VqNF-YC9均可通过自身互作形成同源二聚体。
图3 VqWRKY46与VqNF-YC9相互作用
进一步研究表明， VqNF-YC9 启动子区域含有3种典型的WRKY结合基序W-box（Wbox1: TTGACC；Wbox2: TTGACT；Wbox3: TTGACA）。通过Y1H、EMSA及DLR试验，证实VqWRKY46可直接结合上述W-box元件并激活VqNF-YC9的转录（图4a-d）。实时荧光定量PCR（RT-qPCR）分析显示，VqNF-YC9在 VqWRKY46 过表达株系（OE#4、OE#33）中的表达量显著高于野生型（WT），而在干扰株系（RNAi#16、RNAi#32）中表达量则呈下调趋势（图4e）。上述结果表明，VqWRKY46与VqNF-YC9之间存在双重调控关系：既能通过蛋白互作形成功能复合体，又能通过靶向启动子W-box元件调控 VqNF-YC9 的转录表达，进而构成多层次协同调控网络。通过瞬时转化获得 VqNF-YC9 过表达和缺失转基因植株（OE- VqNF-YC9 、RNAi- VqNF-YC9 ），接种白粉菌后的表型分析表明， VqNF-YC9 过表达可显著增强葡萄对白粉病的抗性（图4f, g）。
图4 VqWRKY46与VqNF-YC9的启动子上W-box元件结合并激活其表达
4.VqNF-YC9增强VqWRKY46对 VqDSC1 启动子的激活作用
为深入鉴定VqWRKY46的直接靶基因，该研究采用DNA亲和纯化测序技术（DAP-seq）进行分析，共鉴定到416个重叠结合峰，其中约28%定位于启动子区域。基序富集分析显示，核心顺式元件为典型W-box（TTGACC/T）（图5a-c）。重点关注到抗病基因 VqDSC1 ，其启动子区域含有3个Wbox1（TTGACC）和4个NF-YC类转录因子结合位点CCAAT。通过Y1H、EMSA及DLR试验，证实VqWRKY46可特异性结合Wbox1并激活 VqDSC1 转录；而VqNF-YC9虽无法直接结合CCAAT位点，但与VqWRKY46互作后可显著增强其对 VqDSC1 启动子的激活作用（图5d-g）。RT-qPCR结果显示， VqDSC1 在 VqWRKY46 过表达株系（OE#4、OE#33）中显著上调，在干扰株系（RNAi#16、RNAi#32）中显著下调，且其表达受白粉菌诱导显著增强（图5h-i）。功能验证表明，瞬时过表达 VqDSC1 （OE- VqDSC1 ）可诱导超敏反应（HR）并增强葡萄白粉病抗性，而干扰株系（RNAi- VqDSC1 ）则表现出感病表型（图5j-k）。综上，该研究揭示VqWRKY46与VqNF-YC9通过形成同源二聚体及蛋白复合体的双重机制，协同调控 VqDSC1 的表达，进而介导葡萄白粉病抗性。研究最终阐明了VqLIMYB-VqWRKY46/VqNF-YC9- VqDSC1 信号模块的抗病调控网络（图6），为葡萄抗病分子育种提供了关键基因靶点及理论支撑。
图5 VqNF-YC9协同VqWRKY46激活抗性基因 VqDSC1 的转录调控
图6 VqLIMYB-VqWRKY46/VqNF-YC9- VqDSC1 信号模块调控葡萄抗白粉病的分子机制
我院已毕业博士研究生张修铭（现任职于宁夏大学葡萄酒与园艺学院）、张祺涵、朱彦勋为论文共同第一作者，王西平教授与美国马里兰大学Hua Lu教授为共同通讯作者。
该研究受国家自然科学基金面上项目（32272693、31872071）及陕西省自然科学基础研究计划项目（2025JC-QYCX-023）资助。
论文链接：https://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/pbi.70196
